Forscher analysieren das Potenzial von Niclosamid als SARS-CoV-2-Behandlung

Eine kürzlich veröffentlichte Studie auf der bioRxiv* Preprint-Server bewertete, ob Niclosamid bei der Therapie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) eingesetzt werden könnte.

Diagramm der Wirkung von Niclosamiden auf den Eintritt von SARS-CoV-2 und die Spike-Protein-vermittelte Synzytienbildung. 1.) SARS-CoV-2 bindet an den ACE2-Rezeptor der Wirtszelle und tritt ein. Es wurde gezeigt, dass Niclosamid diesen Eintrittsschritt in vitro hemmt. 2.) Die virale Replikation erzeugt viele Kopien des RNA-Genoms. 3.) Die Infektion führt zu einer erhöhten Expression von viralem Spike (S)-Protein und TMEM16F der Wirtszelle an der Plasmamembran. 4.) Das S-Protein an der Oberfläche einer infizierten Zelle bindet an den ACE2-Rezeptor einer benachbarten, nicht infizierten Zelle. 5.) Spike-abhängige Synzytienbildung wird durch die Calcium-abhängige Lipid-Scramblase TMEM16F vermittelt, um mehrkernige infizierte Zellkörper zu erzeugen. Es wurde gezeigt, dass Niclosamid, ein Inhibitor von TMEM16F, die Spike-abhängige Synzytienbildung blockiert.

Hintergrund

Therapeutika gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), die die Virusübertragung stoppen oder behandeln können, werden weiterhin dringend benötigt.

Niclosamid, das von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene orale Anthelminthikum, hat breite biologische Funktionen, einschließlich antibakterieller, antiviraler und krebshemmender Wirkungen. Jüngste Berichte zeigten, dass Niclosamid ein starker Inhibitor von COVID-19 war in-vitrowas das Interesse an seiner Anwendung zur Vorbeugung oder Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen weckt.

Nichtsdestotrotz gibt es verschiedene potenzielle Nachteile bei der Verwendung von Niclosamid bei COVID-19. Zu diesen Nachteilen gehörten eine hohe Zelltoxizität, eine signifikante Polypharmakologie, eine geringe Bioverfügbarkeit und eine unsichere Wirksamkeit von Niclosamid gegen auftretende SARS-CoV-2-Varianten von Bedenken (VOCs).

Über das Studium

In der aktuellen Studie setzten die Forscher der University of Michigan High-Content Imaging-basierte Immunfluoreszenz-Experimente in zwei unterschiedlichen Zellmodellen ein, um die Grenzen und die Möglichkeit des Einsatzes von Niclosamid als antivirales SARS-CoV-2 zu bestimmen.

Das Team weitete die Analysen auf 33 Niclosamid-Strukturanaloga aus, um eine vorläufige Charakterisierung des Zusammenhangs zwischen Struktur und Aktivität zu erstellen, was möglicherweise die zukünftige Generation von Verbindungen mit Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit und wenigen Off-Target-Auswirkungen unterstützt. Darüber hinaus verwendeten sie High-Content-Fluoreszenzbildgebung, um einen Selektivitätsindex für Niclosamid über zwei verschiedene Zelltypen abzuschätzen, um die Toxizität von Niclosamid zu untersuchen. Die verwendeten Zellmodelle waren die physiologisch relevantere humane Lungenadenokarzinom-Zelllinie H1437 und VeroE6.

Darüber hinaus bewerteten die Autoren in VeroE6-Zellen die Wirksamkeit von Niclosamid gegen SARS-CoV-2 Alpha (B.1.1.7), Wildtyp (WA1), Beta (B.1.351), Gamma (P.1) und Delta (B.1.617.2) Varianten. Schließlich untersuchten sie die Auswirkungen der Niclosamid-Therapie auf COVID-19 anhand der morphologischen Charakterisierung von mit Alpha infizierten VeroE6-Zellen, um den Wirkmechanismus (MOA) zu bestimmen.

Ergebnisse

Die Studienergebnisse zeigten, dass Niclosamid einen dramatisch niedrigen Selektivitätsindex in VeroE6- und H1437-Zelllinien nach 72-stündiger Exposition gegenüber der Verbindung aufweist. Diese Schlussfolgerung deutete darauf hin, dass Niclosamid, selbst wenn eine signifikant angemessene Exposition gegenüber der Verbindung für die Wirksamkeit von Anti-SARS-CoV-2 in der Lunge auftritt, wahrscheinlich ein begrenztes therapeutisches Fenster im klinischen Umfeld hätte.

Niclosamid ist bei antiviralen Konzentrationen nach längerer Exposition toxisch.  A.) Arbeitsablauf für High-Content-Anti-SARS-CoV-2-Bioassay-Screening zur Bestimmung der Infektionshemmung und Zytotoxizität.  B.) 10-Punkte, 2-fach verdünnte Konzentrations-Antwort-Kurven für VeroE6- und H1437-Zellen mit einer Ausgangskonzentration von 10 μM.  VeroE6-Zellen wurden mit der Variante SARS-CoV-2 B.1.1.7 mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 infiziert, während H1437 mit der Variante SARS-CoV-2 WA1 mit einer MOI = 1 infiziert wurden, um eine optimale Infektion bei 48 zu erreichen Stunden nach der Infektion.  Datenpunkte repräsentieren Mittelwert ± SEM für

Niclosamid ist bei antiviralen Konzentrationen nach längerer Exposition toxisch. A.) Arbeitsablauf für High-Content-Anti-SARS-CoV-2-Bioassay-Screening zur Bestimmung der Infektionshemmung und Zytotoxizität. B.) 10-Punkte, 2-fach verdünnte Konzentrations-Antwort-Kurven für VeroE6- und H1437-Zellen mit einer Ausgangskonzentration von 10 μM. VeroE6-Zellen wurden mit der Variante SARS-CoV-2 B.1.1.7 mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 infiziert, während H1437 mit der Variante SARS-CoV-2 WA1 mit einer MOI = 1 infiziert wurden, um eine optimale Infektion bei 48 zu erreichen Stunden nach der Infektion. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SEM für N=10 Wiederholungen pro Bedingung dar. Die Kurvenanpassung wurde in GraphPad Prism 9.0 unter Verwendung eines halblogarithmischen Modells mit variabler Steigung und 4 Parametern durchgeführt. Repräsentative Überlagerungsbilder für Schein-, Vehikel- und 10-μM-Niclosamid-Behandlung (infiziert) sind enthalten (Cyan = Kerne, Magenta = SARS-CoV-2 N-Protein).

Trotz ermutigender vorläufiger Ergebnisse zeigten die Autoren, dass Niclosamid eine schlechte Wirkung hat in-vitro Selektivitätsindex für die Hemmung von SARS-CoV-2, da seine antivirale Aktivität mit seiner Zytotoxizität zusammenfällt. Sie zeigen ferner, dass die Wirksamkeit von Niclosamid gegen die VOCs von SARS-CoV-2 stark variiert und von 298 nM für die Beta-Variante bis 1664 nM für den Wildtyp reicht und dass es besonders wirksam gegen Varianten mit einer größeren Ausbreitung von Zelle zu Zelle war, wie z Alpha. Gemäß zusätzlicher morphologischer Einzelzellcharakterisierung verhindert Niclosamid auch den Eintritt von SARS-CoV-2 und die Ausbreitung von Zelle zu Zelle durch Synzytien.

Das Team entdeckte acht Niclosamid-Analoga (Verbindungen 34, 24, 22, 11, 10, 4, 3, 2), die sowohl im H1437- als auch im VeroE6-Zellmodell wirksam waren. Vier davon (Verbindungen 24, 11, 7 und 2) zeigten verringerte Zytotoxizitäten und eine verbesserte Potenz als Niclosamid in VeroE6. Infolgedessen glaubten sie, dass es ein Potenzial zur Herstellung von Niclosamid-Analoga mit besseren Eigenschaften gab.

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Die Niclosamid-Wirksamkeit ist von der SARS-CoV-2-Variante abhängig.  A.) Assay-Zeitplan für das 24-Stunden-Infektionsexperiment.  Das Testfenster wurde verkürzt, um die Toxizität von Niclosamid zu reduzieren.  B.) 10-Punkte-2-fache Konzentrations-Antwort-Kurven für Niclosamid gegen die verschiedenen betroffenen SARS-CoV-2-Varianten (MOI = 0,1 für jede Variante) mit einer Spitzenkonzentration von 10 μM.  Die Kurven wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0 unter Verwendung eines halblogarithmischen Modells mit variabler Steigung und 4 Parametern angepasst.  Die Daten für jede Variante wurden auf den durchschnittlichen Prozentsatz der Infizierten ihrer jeweiligen Viruskontrolle normalisiert.  Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SEM für n = 3 Wiederholungen dar.  C.) IC50-Werte für die Niclosamid-Potenz gegen besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten.  Die Werte wurden aus der Kurvenanpassung mit GraphPad 9.0 extrahiert und enthalten SEM-Fehlerbalken (WA1: 1664 ± 149 nM, B.1.1.7: 298 ± 23 nM, B.1.351: 440 ± 21 nM, B.1.617.2: 774 ± 58 nM, P.1: 399 ± 34 nM).  Die Signifikanz wurde unter Verwendung von Student's T-Tests bestimmt (* = P < 0,05, ** = P<0.01).

Die Niclosamid-Wirksamkeit ist von der SARS-CoV-2-Variante abhängig. A.) Assay-Zeitplan für das 24-Stunden-Infektionsexperiment. Das Testfenster wurde verkürzt, um die Toxizität von Niclosamid zu reduzieren. B.) 10-Punkte-2-fache Konzentrations-Antwort-Kurven für Niclosamid gegen die verschiedenen betroffenen SARS-CoV-2-Varianten (MOI = 0,1 für jede Variante) mit einer Spitzenkonzentration von 10 μM. Die Kurven wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0 unter Verwendung eines halblogarithmischen Modells mit variabler Steigung und 4 Parametern angepasst. Die Daten für jede Variante wurden auf den durchschnittlichen Prozentsatz der Infizierten ihrer jeweiligen Viruskontrolle normalisiert. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert ± SEM für N=3 Wiederholungen dar. C.) IC50-Werte für die Niclosamid-Potenz gegen besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten. Die Werte wurden aus der Kurvenanpassung mit GraphPad 9.0 extrahiert und enthalten SEM-Fehlerbalken (WA1: 1664 ± 149 nM, B.1.1.7: 298 ± 23 nM, B.1.351: 440 ± 21 nM, B.1.617.2: 774 ± 58 nM, P.1: 399 ± 34 nM). Die Signifikanz wurde unter Verwendung von Student’s T-Tests bestimmt (* = P < 0,05, ** = P < 0,01).

Darüber hinaus deckte die aktuelle Struktur-Aktivitäts-Untersuchung bestimmte mechanistische Aspekte von Niclosamid auf. Am wichtigsten ist, dass beide in dieser Studie verwendeten Zellmodelle nach der Entfernung der Hydroxylgruppe des Protonophors ihre Funktion einstellten. Diese Schlussfolgerung deutete darauf hin, dass die unspezifische endolysosomale Neutralisation die hauptsächliche MOA war.

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Die Wirksamkeit der Analoga hing stark davon ab, wie schwach sauer und lipophil sie waren. Da Carbonsäuresubstituenten vorhanden waren, waren Analoge mit hoher vorhergesagter Acidität (pKa) typischerweise vollständig inaktiv. Das Team entdeckte auch, dass andere Protonophore wie Oxyclozanid und Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) eine Anti-SARS-CoV-2-Aktivität zeigten. Diese Beobachtung zeigte, dass die Fähigkeit von Niclosamid, pH-Gradienten zu stören, für seine MOA wesentlich war.

Schlussfolgerungen

Insgesamt zeigte die aktuelle Studie, dass Niclosamid angesichts seiner begrenzten Bioverfügbarkeit, unspezifischen Protonophorfunktion, variantenabhängigen Wirksamkeit, schwachen Selektivitätsindex und komplexen Polypharmakologie keine gute Wahl für die Behandlung von COVID-19 war. Dennoch zeigten die Ergebnisse, dass die Anilin- und Salicylringe von Niclosamid modifiziert werden konnten, um die Selektivität und Bioverfügbarkeit zu verändern, während die Wirkung des Medikaments erhalten blieb. Somit stellt Niclosamid eine hilfreiche chemische Sonde bereit, die in einem massiven Streben nach Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) genutzt werden könnte, um in Zukunft bessere Analoga zu bauen.

Die Forscher wiesen darauf hin, dass längere Niclosamid-Expositionen bei wirksamen Anti-SARS-CoV-2-Konzentrationen wahrscheinlich zu spürbaren Nebenwirkungen führen, was die praktische Anwendung einschränkt. Daher die Sicherheit von Niclosamid bei antiviralen Titern in vivo bedarf weiterer Untersuchung.

Außerdem könnte die Entwicklung von De-novo-Medikamenten für COVID-19 von zusätzlicher Forschung zu den molekularen Variationen hinter den auf SARS-CoV-2-Varianten basierenden Reaktionen auf Medikamente wie Niclosamid profitieren.

Obwohl die aktuelle Arbeit zeigt, dass Niclosamid und ähnliche mitochondriale Entkoppler eine Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit haben, waren zusätzliche Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, ob diese MOA mit der Protonophoraktivität in Verbindung stehen.

*Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die keinem Peer-Review unterzogen wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die klinische Praxis/das gesundheitsbezogene Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

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