Näherungskennzeichnung zur Identifizierung von hochgradig zuverlässigen SARS-CoV-2-Interaktoren

Ein kürzlich veröffentlichter Bericht in der STAR-Protokolle Das Journal stellte ein Protokoll für eine Antikörper-basierte Proximity-Markierung vor, um biotinylierte Interaktoren des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu entdecken.

Studie: Ein Antikörper-basiertes Proximity-Labeling-Protokoll zur Identifizierung biotinylierter Interaktoren von SARS-CoV-2. Bildnachweis: Star Protocols

Hintergrund

Das Zusammenspiel zwischen Wirts- und SARS-CoV-2-Komponenten ist entscheidend für den viralen Lebenszyklus bei der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Die molekularen Mechanismen der viralen Pathogenität sind aufgrund der Komplexität der Virus-Wirt-Interaktion kaum verstanden. Das Verständnis viraler Proteinaktivitäten während einer Infektion erfordert die Darstellung des Virus-Wirt-Interaktoms.

Ein Streptavidin-Anreicherungsansatz wurde kürzlich verwendet, um proximale Proteine ​​von SARS-CoV-2 auf der Grundlage von BioID zu untersuchen, einer Technik zur Identifizierung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Dennoch waren die biotinylierten Peptide aufgrund der signifikanten Bindungsaffinität von Biotin und Streptavidin schwer zu lokalisieren, was für die Messung der Gewissheit von Näherungskontakten entscheidend war.

Über das Studium

In der vorliegenden Studie stellten die Autoren ein Protokoll zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Protein-Interaktoren unter Verwendung der auf einem Antikörper basierenden TurboID-Proximity-Labeling-Technik bereit. TurboID ist eine Biotin-Ligase, die Biotin mithilfe von Adenosintriphosphat (ATP) in Biotin-Adenosin-Monophosphat (AMP) umwandelt. Die Wissenschaftler nutzten einen Biotin-spezifischen Antikörper, um proximale Proteine ​​von SARS-CoV-2 mit biotinylierten Peptiden zu verstärken, die mit TurboID-markierten Virusproteinen markiert waren.

Das Team erläuterte die Verfahren zur Vorbereitung biotinylierter Peptidproben für die Massenspektrometrie (MS)-Analyse. Sie beschrieben auch einen strengen Arbeitsablauf zur Identifizierung biotinylierter hochzuverlässiger Interaktoren von SARS-CoV-2 durch das Screening unspezifischer co-gereinigter Proteine.

Protokoll im Detail

Die Autoren konstruierten über sechs Wochen die Expressionsvektoren für SARS-CoV-2-Proteine. TurboID-Expressionsvektoren mit SARS-CoV-2-proteinkodierenden Sequenzen wurden verwendet, um mit TurboID markierte virale Proteine ​​zu erzeugen, und ihre Expression wurde verifiziert. Die Autoren gaben an, dass das Transfektionsreagenz durch Turbofect oder Lipofectamine 2000 ersetzt werden könnte.

Die Annäherungsmarkierung durch TurboID-getaggte SARS-CoV-2-Proteine ​​wurde über eine Woche durchgeführt. TurboID-markierte SARS-CoV-2-Expressionsvektoren wurden in humane embryonale Nierenzellen 293T (HEK293T) transfiziert, um proximale Proteine ​​zu biotinylieren. Die Forscher betonten die Notwendigkeit äußerster Vorsicht beim Wechseln der Kulturmedien, um Zellverluste zu vermeiden, da sich HEK293T-Zellen leicht von den Platten trennen ließen. Die Pulszeit und die Leistungskapazität der Beschallung konnten bis zum Erreichen einer klaren Zelllyse eingestellt werden. Der Blockierungspuffer für Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) und Rinderserumalbumin (BSA) sollte frisch zubereitet werden.

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Der Proteinaufschluss durch filtergestützte Probenvorbereitung (FASP) wurde über zwei Tage durchgeführt. Zelllyseproteine ​​wurden alkyliert, minimiert und in Zentrifugalfiltereinheiten verdaut. Die Forscher beschafften und trockneten die verdauten Peptidkombinationen.

Ebenso wurden auch Peptidverstärkung und Entsalzung in zwei Tagen durchgeführt. Verdaute Peptide wurden unter Verwendung des Anti-Biotin-Antikörpers vermehrt. StageTips wurden verwendet, um die extrahierten Peptide zu entsalzen, und Vakuumzentrifugation wurde verwendet, um sie zu trocknen. Schließlich führte das Team eine Woche lang eine MS- und Datenanalyse durch.

Voraussichtliche Ergebnisse

Die Autoren erwähnten, dass die biotinylierten Peptide, die mit den von TurboID markierten SARS-CoV-2-Proteinen markiert waren, mit dem vorliegenden Ansatz direkt identifiziert wurden. Nach rigoroser Datenverarbeitung wurden diese signifikant verbesserten Proteine ​​mit biotinylierten Regionen in Probengruppen als hochgradig zuverlässige Interaktoren von SARS-CoV-2-Proteinen identifiziert.

Die Generierung von TurboID-markierten SARS-CoV-2-Proteinen und ihre Fähigkeit, proximale Interaktoren zu markieren, ermöglicht eine gründliche Interaktom-Untersuchung von Wirtskomponenten und viralen Proteinen. Das vorliegende Protokoll verwendete einen Anti-Biotin-Antikörper, um proximale Proteine ​​zu erwerben, die biotinylierte Stellen beherbergen. Dies führte zur Erkennung von 1388 proximal interagierenden Molekülen von SARS-CoV-2-Proteinen mit hoher Zuverlässigkeit, von denen 1092 nicht durch die Streptavidin-basierte BioID-Analyse in der SARS-CoV-2-Interaktomforschung untersucht wurden. Somit werden die Vorteile der Antikörper-basierten TurboID-Technik bei der Lokalisierung proximaler Interaktoren demonstriert. Die resultierenden Daten werden bei der Entdeckung der SARS-CoV-2-Pathogenese und der Entwicklung der COVID-19-Therapie helfen.

Lösung von Problemen

Die Autoren schlugen Lösungen für einige der Probleme vor, die während der Analysen aufgetreten sind:

1. Schlechtes Transfektionspotential von TurboID-Fusionsexpressionsvektoren. Mögliche Lösung: Das bei -20 °C aufbewahrte aliquotierte Polyetherimid (PEI) sollte sich bei Raumtemperatur (RT) vollständig auflösen. Unlösliche Partikel können fast eine halbe Stunde lang auf 65°C erhitzt werden, bis die Lösung klar wird. Minimieren Sie außerdem die Gefrier-Tau-Zyklen von PEI.

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2. Western Blots identifizierten die Expression von TurboID-markierten SARS-CoV-2-Proteinen nicht. Mögliche Lösung: Die Substitution des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors durch den CMV-Enhancer, den Hühner-&bgr;-Aktin-Promotor und die Kaninchen-&bgr;-Globin-Spleißakzeptorstelle (CAG) des Vektors verstärkt ihre Expression. Verbessern Sie für den eukaryotischen Expressionsvektor die komplementären Desoxyribonukleinsäure (cDNA)-Codons des viralen offenen Leserahmens (ORF). Zusätzlich sollten virale Proteine ​​und TurboID alternativ orientiert werden.

3. Niedrige Expression von biotinylierten Proteinen, identifiziert durch Western Blot. Mögliche Lösung: Ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion für hochmolekulare virale Proteine, die zur Biotinylierung und zum Nachweis proximaler Proteine ​​führen.

4. Ceratin-biotinylierte Proteine ​​waren drastisch schwach, um durch Western Blot unter Verwendung von Streptavidin-HRP nachgewiesen zu werden. Mögliche Lösung: Bestimmte virale Proteine ​​mit TurboID-Tag besitzen schwächere Biotinylierungssignale und greifen mit wenigen proximalen Proteinen ein als andere. Stapeln Sie TurboID immer ohne und mit Biotinkontrollen, die Proben enthalten, auf derselben Membran, um die Probenbiotinylierung zu validieren.

5. Biotinylierte Proteine ​​wurden effektiv erkannt, obwohl Flüssigchromatographie mit Tandem-MS (LC-MS-MS) nur weniger Proteine ​​identifizierte. Mögliche Lösung: Dies könnte dem Proteinverlust beim Perlenwaschverfahren zugeschrieben werden. Pipettieren Sie nicht viel auf und ab, um zu vermeiden, dass Kügelchen an den Pipettenspitzen haften bleiben. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig ohne Kügelchen.

Zeitschriftenreferenz:

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