SARS-CoV-2 aktiviert Mikroglia im Gehirn

In einer kürzlich veröffentlichten Studie über die bioRxiv* Preprint-Servers zeigen Forscher, dass das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) die menschliche Mikroglia infizieren kann.

Lernen: SARS-CoV-2-Infektion von Mikroglia löst proinflammatorische Aktivierung und apoptotischen Zelltod aus. Bildquelle: Kateryna Kon / Shutterstock.com

Hintergrund

Verschiedene Studien haben darauf hingewiesen, dass eine SARS-CoV-2-Infektion bei Patienten mit der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) zu neurologischen Symptomen führen könnte; über diese neurologischen Manifestationen ist jedoch wenig bekannt. Mikroglia sind Makrophagen-ähnliche Immunzellen im Gehirn und im zentralen Nervensystem (ZNS), die die Homöostase des Gehirns aufrechterhalten und bekannt dafür sind, schnell auf Verletzungen und Entzündungen zu reagieren. Als Reaktion auf einen immunologischen Reiz nehmen Mikrogliazellen eine amöboide Morphologie an und setzen Interleukine (IL) wie IL-1β und IL-6 und Tumornekrosefaktor-α (TNFα) frei.

Mikroglia zeigen bei Aktivierung duale Phänotypen. Während M1 als der klassisch aktivierte Zustand gilt, ist M2 der alternierend aktivierte Zustand.

Der M1-Phänotyp ist an Neuroinflammation beteiligt und neurotoxisch; umgekehrt ist der M2-Phänotyp neuroprotektiv. Obwohl viel über die Aktivierung und Reaktion von Mikroglia bekannt ist, ist weitere Forschung erforderlich, um die mikrogliale Wirts-Immunantwort bei Patienten zu charakterisieren und zu verstehen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind.

Über das Studium

Die Forscher untersuchten in der vorliegenden Studie die Faktoren, die bei COVID-19-Patienten zu Neuroinflammation und anderen neurologischen Komplikationen führen. Diese Arbeit wurde in erster Linie als Reaktion auf mehrere Berichte über Mikrogliose, Ansammlung von Immunzellen und Mikrogliaknötchen in der Medulla oblongata und den Nuclei dentatus des Kleinhirns im Gehirn verstorbener COVID-19-Patienten durchgeführt, die durch eine massive Aktivierung von Mikrogliazellen entstehen.

Das Team untersuchte, ob SARS-CoV-2 menschliche Mikrogliazellen infizieren kann, indem es die menschliche embryonale primäre Mikroglia (HMC3) mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von SARS-CoV-2 beimpfte. Darüber hinaus wurden auch andere SARS-CoV-2-anfällige Zelllinien wie Caco-2- und Vero-E6-Zellen infiziert.

Studienergebnisse

Die Forscher fanden heraus, dass SARS-CoV-2 HMC3 infizierte und dass diese Infektion den Tod von HMC3-Zellen auslöste und einen zytopathischen Effekt (CPE) aufwies. Die Autoren untersuchten auch, ob eine SARS-CoV-2-Infektion einen M1- oder M2-Phänotyp der Mikroglia hervorruft und analysierten die differentiell exprimierten Gene (DEGs), die mit der Mikroglia-Polarisation verbunden sind.

<img alt="SARS-CoV-2 infiziert direkt menschliche Mikrogliazellen und löst CPE aus. Eine HMC3-, Caco-2- und Vero-E6-Zellen wurden mit einem MOI von SARS-CoV-2 infiziert. Die gesamte zelluläre RNA wurde bei 2, 4 und 6 dpi extrahiert, um die virale RNA des SARS-CoV-2 NP-Gens durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nachzuweisen. Das Diagramm zeigt virale RNA-Kopien pro Mikrogramm zellulärer Gesamt-RNA an jedem Tag. B Die von SARS-CoV-2-infizierten Zellen abgeleiteten Kulturmedien wurden seriell verdünnt und für den Fokusbildungstest verwendet. Die Grafik zeigt den sezernierten Virustiter als fokusbildende Einheiten (FFU). C Das Diagramm zeigt virale RNA-Kopien pro Mikrogramm zellulärer Gesamt-RNA bei 2 dpi nach Behandlung mit der zunehmenden Menge des neutralisierenden Antikörpers CR3022. D Konfokale Bilder von SARS-CoV-2-infiziertem HMC3 (obere Reihe), Caco-2 (mittlere Reihe) und Vero E6 (untere Reihe), die die Infektion dieser Zellen durch Immunfluoreszenzassay mit Anti-SARS-CoV-2 NP . zeigen und Anti-dsRNA-Antikörper. Maßstabsbalken = 100 µm. E Western-Blotting von SARS-CoV-2 NP in jeder infizierten Zelle. Als Beladungskontrolle diente das 70-KDa-Hitzeschockprotein (Hsp70). F Phasenkontrastbilder des Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten HMC3 in Abwesenheit/Anwesenheit des neutralisierenden Antikörpers CR3022 bei 2, 4 und 6 dpi, die den Zelltod als CPE durch Mikroskopie anzeigen. Maßstabsbalken = 200 µm. G Bilder der Kristallviolett-Färbung des Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten HMC3 in Abwesenheit/Anwesenheit des neutralisierenden Antikörpers CR3022, plattiert in der 12-Well (oben). Die Grafik zeigt die prozentualen Messungen der mit Kristallviolett gefärbten zellbedeckten Bereiche des ImmunoSpot-Lesegeräts (unten). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Student-t-Test bestimmt; *P < 0,05; **P

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SARS-CoV-2 infiziert direkt menschliche Mikrogliazellen und löst CPE aus. Eine HMC3-, Caco-2- und Vero-E6-Zellen wurden mit einem MOI von SARS-CoV-2 infiziert. Die gesamte zelluläre RNA wurde bei 2, 4 und 6 dpi extrahiert, um die virale RNA des SARS-CoV-2 NP-Gens durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nachzuweisen. Das Diagramm zeigt virale RNA-Kopien pro Mikrogramm zellulärer Gesamt-RNA an jedem Tag. B Die von SARS-CoV-2-infizierten Zellen abgeleiteten Kulturmedien wurden seriell verdünnt und für den Fokusbildungstest verwendet. Die Grafik zeigt den sezernierten Virustiter als fokusbildende Einheiten (FFU). C Das Diagramm zeigt virale RNA-Kopien pro Mikrogramm zellulärer Gesamt-RNA bei 2 dpi nach Behandlung mit der zunehmenden Menge des neutralisierenden Antikörpers CR3022. D Konfokale Bilder von SARS-CoV-2-infiziertem HMC3 (obere Reihe), Caco-2 (mittlere Reihe) und Vero E6 (untere Reihe), die die Infektion dieser Zellen durch Immunfluoreszenzassay mit Anti-SARS-CoV-2 NP . zeigen und Anti-dsRNA-Antikörper. Maßstabsbalken = 100 µm. E Western-Blotting von SARS-CoV-2 NP in jeder infizierten Zelle. Als Beladungskontrolle diente das 70-KDa-Hitzeschockprotein (Hsp70). F Phasenkontrastbilder des Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten HMC3 in Abwesenheit/Anwesenheit des neutralisierenden Antikörpers CR3022 bei 2, 4 und 6 dpi, die den Zelltod als CPE durch Mikroskopie anzeigen. Maßstabsbalken = 200 µm. G Bilder der Kristallviolett-Färbung des Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten HMC3 in Abwesenheit/Anwesenheit des neutralisierenden Antikörpers CR3022, plattiert in der 12-Well (oben). Die Grafik zeigt die prozentualen Messungen der mit Kristallviolett gefärbten zellbedeckten Bereiche des ImmunoSpot-Lesegeräts (unten). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Student-t-Test bestimmt; *P < 0,05; **P < 0,01. Symbole repräsentieren Mittelwert ± SEM.

Es wurde ein Anstieg der Ribonukleinsäure (RNA)-Expressionsniveaus von M1-Phänotyp-verwandten Genen wie IL-1β, IL-6 und CXCl1 beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass eine SARS-CoV-2-Infektion eine proinflammatorische Aktivierung induziert, die zum M1-Phänotyp in HMC3 führt.

Darüber hinaus bestimmten die Forscher den Mechanismus des Todes von HMC3-Zellen, der durch eine SARS-CoV-2-Infektion ausgelöst wurde. Western-Blot-Analysen ergaben, dass in den SARS-CoV-2-infizierten HMC3-Zellen apoptotische Proteine, die sowohl mit intrinsischen als auch mit extrinsischen Apoptosewegen assoziiert sind, hervorgerufen wurden.

Todesrezeptor (DR)-vermittelte Proteine ​​des extrinsischen apoptotischen Weges wie Fas, Todesrezeptor 4 (DR4), DR5 und TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) wurden auf den Western Blots beobachtet. Darüber hinaus nahm die Expression von Bcl-2 (Apoptosesuppressor) ab, während die von Bim, Bid und Bax zunahm. Diese Ergebnisse zeigen, dass SARS-CoV-2 den Zelltod von HMC3-Zellen über beide Wege der Apoptose induziert.

Mehrere andere RNA-Viren wie das Zika-Virus (ZIKV) und das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) verursachen in den meisten Immunzellen Pyroptose oder entzündlichen Zelltod. Das Team stellte fest, ob Pyroptose durch eine SARS-CoV-2-Infektion in HMC3 induziert wird und berichtete, dass Pyroptose aufgrund von SARS-CoV-2 in HMC3-Zellen nicht nachgewiesen wurde und kam zu dem Schluss, dass der Zelltod auf Apoptose zurückzuführen war.

Transgene Mäuse (K18-hACE2), die humanes ACE2 mit einem Cytokeratin-18-Genpromotor exprimieren, wurden mit 2 x 104 Plaque-bildende Einheiten (PFUs) von SARS-CoV-2. Nach sechs Tagen Infektion wurde bei infizierten Mäusen ein Gewichtsverlust von etwa 20 % ihres Körpergewichts beobachtet und in ihren Gehirnen wurde virale RNA nachgewiesen.

<img alt="Mikrogliale proinflammatorische Aktivierung und Depopulation durch SARS-CoV-2-Infektion bei K18-hACE2-Mäusen. Ein Schema des Experiments für B bis H, erstellt mit BioRender.com. Nach sechs Tagen wurden Gehirne von Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten Mäusen extrahiert und für eine Percoll-Gradientenzentrifugation verwendet, um mononukleare Zellen mit Mikroglia für die Durchflusszytometrie-Analyse zu isolieren. Die Zelloberfläche isolierter mononukleärer Zellen wurde mit CD11b- und CD45-Antikörpern gefärbt. B Repräsentatives Flow-Plot mit Gating auf Leukozyten zeigt Gating für Mikroglia (MI, CD11b+, CD45Low), Makrophagen (Mϕ, CD11b+, CD45High) und Lymphozyten (Lym, CD11b-, CD45High). CE-Balkendiagramme zeigen die Anzahl der Mikroglia (C), Lymphozyten (D) und Makrophagen (E), die pro Gehirn bei 6 dpi isoliert wurden. F Repräsentatives Flussdiagramm, das auf Mikroglia gegatet ist, zeigt aktivierte Mikroglia mit stark exprimiertem IL-6 und TNF-α, um aktivierte von verzweigten Mikroglia zu trennen. GH-Balkendiagramme zeigen den Prozentsatz aktivierter Mikroglia, die IL-6 (G) und TNF-α (H) stark exprimieren. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Student-t-Test bestimmt; *P < 0,05; ***P < 0,001; ****P

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Mikrogliale proinflammatorische Aktivierung und Depopulation durch SARS-CoV-2-Infektion bei K18-hACE2-Mäusen. Ein Schema des Experiments für B bis H, erstellt mit BioRender.com. Nach sechs Tagen wurden Gehirne von Schein- oder SARS-CoV-2-infizierten Mäusen extrahiert und für eine Percoll-Gradientenzentrifugation verwendet, um mononukleare Zellen mit Mikroglia für die Durchflusszytometrie-Analyse zu isolieren. Die Zelloberfläche isolierter mononukleärer Zellen wurde mit CD11b- und CD45-Antikörpern gefärbt. B Repräsentatives Flow-Plot mit Gating auf Leukozyten zeigt Gating für Mikroglia (MI, CD11b+, CD45Low), Makrophagen (Mϕ, CD11b+, CD45High) und Lymphozyten (Lym, CD11b-, CD45High). CE-Balkendiagramme zeigen die Anzahl der Mikroglia (C), Lymphozyten (D) und Makrophagen (E), die pro Gehirn bei 6 dpi isoliert wurden. F Repräsentatives Flussdiagramm, das auf Mikroglia gegatet ist, zeigt aktivierte Mikroglia mit stark exprimiertem IL-6 und TNF-α, um aktivierte von verzweigten Mikroglia zu trennen. GH-Balkendiagramme zeigen den Prozentsatz aktivierter Mikroglia, die IL-6 (G) und TNF-α (H) stark exprimieren. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Student-t-Test bestimmt; *P < 0,05; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. Symbole repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM).

Schlussfolgerungen

Die vorliegende Studie zeigt, dass SARS-CoV-2 Mikroglia infiziert und deren anschließende Aktivierung und Umwandlung in einen proinflammatorischen M1-Phänotyp induziert. Darüber hinaus ist der Tod von Mikrogliazellen aufgrund einer SARS-CoV-2-Infektion apoptotisch, und es wurden sowohl extrinsische als auch intrinsische Wege der Apoptose beobachtet.

Eine Zunahme neurotoxischer Mikroglia (M1-Zellen) kann zu anderen neurologischen Komplikationen führen, wie der Aktivierung von Astrozyten und T-Lymphozyten, die neuronale Schäden und den Tod verursachen können. Darüber hinaus könnte die Blut-Hirn-Schranke durch die Freisetzung von Zytokinen durch Mikroglia gestört werden, die bei COVID-19-Patienten zusätzliche neurologische Symptome verursachen können.

In vivo Untersuchungen an transgenen Mäusen berichteten über die Infektion von Mikroglia durch SARS-CoV-2, die die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen induziert und in der Folge einen chronischen Verlust von Mikroglia verursacht hat. Diese Ergebnisse deuten auf einen Mangel an Immunantwort im Gehirn hin; daher kann die erhöhte Virusreplikation zu unterschiedlichen neurologischen Manifestationen führen.

Die in dieser Studie gemachten Beobachtungen legen nahe, dass Mikrogliazellen für therapeutische Interventionen bei COVID-19-Patienten mit neurologischen Symptomen gezielt eingesetzt werden könnten.

*Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die keinem Peer-Review unterzogen wurden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, die die klinische Praxis/das gesundheitsbezogene Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

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