SARS-CoV-2 kann Paxlovid durch mehrere Mechanismen entgehen

In einem kürzlich veröffentlichten Artikel auf der bioRxiv* Preprint-Server zeigten Forscher von Rutgers, der State University of New Jersey, der University of South Florida und der Catholic University of America, dass die Hauptprotease (MProfi)-Mutationen führen zu einer Nirmatrelvir-Resistenz.

Lernen: Natürlich vorkommende Mutationen der SARS-CoV-2-Hauptprotease verleihen Nirmatrelvir eine Arzneimittelresistenz. Bildnachweis: Orpheus FX / Shutterstock

Hintergrund

Die anhaltende SARS-CoV-2-Pandemie unterstreicht die Dringlichkeit oral bioverfügbarer antiviraler Medikamente. SieProfi von SARS-CoV-2 ist eine Cysteinprotease und ein anerkanntes Ziel für antivirale Medikamente. Paxlovid (Nirmatrelvir) und Molnupiravir sind die einzigen beiden oralen SARS-CoV-2-Medikamente, die die Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) erhalten haben. Paxlovid umfasst die MProfi Inhibitor Nirmatrelvir und der Stoffwechselverstärker Ritonavir.

Das Risiko einer Krankenhauseinweisung oder des Todes war bei Patienten mit Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die Paxlovid weniger als drei Tage nach Beginn der SARS-CoV-2-Symptome erhielten, um 89 % geringer als bei Patienten, die das Placebo erhielten. Dennoch ist das Auftreten von SARS-CoV-2-Varianten mit MProfi Mutationen führten zu Bedenken hinsichtlich einer möglichen Arzneimittelresistenz.

Über das Studium

Die vorliegende Arbeit versuchte, MProfi arzneimittelresistente SARS-CoV-2-Mutanten, die mit natürlich vorkommenden Polymorphismen assoziiert sind. Die Forscher untersuchten die SARS-CoV-2-Sequenzen in der Datenbank der Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data (GISAID).

Das Team untersuchte die Arzneimittelresistenz von drei MProfi Inhibitoren: PF00835231, GC-376 und Nirmatrelvir. GC-376 wurde zur Behandlung einer Infektion mit dem felinen infektiösen Peritonitisvirus (FIPV) bei Katzen verwendet. Darüber hinaus entwickelte Pfizer das Phosphonat PF-00835231-Prodrug als intravenöses Mittel zur Behandlung von COVID-19-Patienten in Krankenhäusern und wurde in die klinische Studie überführt. Schließlich war Nirmatrelvir der Wirkstoff in Paxlovid.

Die Autoren konzentrierten sich auf 12 MProfi Reste des aktiven Zentrums, M49, H41, N142, T135, S144, H164, H163, M165, H172, E166 und Q189, gefunden innerhalb von 6 Å der Nirmatrelvir-Bindungsdomäne, d. h. PDB: 7SI9, um arzneimittelresistente MProfi Mutanten. Sie schlugen vor, dass Mutationen über die Reste des aktiven Zentrums sich direkt auf die Substrathaftung und die Arzneimittelresistenz auswirken. Um diese Theorie zu testen, bewerteten die Forscher die Mutationen in diesen 12 Resten unter Verwendung der SARS-CoV-2-Sequenzen aus dem GISAID.

Die Bewertung der Bindung durch thermische Verschiebung und ein enzymatischer Assay auf der Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) wurden verwendet, um die Arzneimittelempfindlichkeit zu bestimmen. Das SARS-CoV-2 MProfi mutante Proteine ​​wurden exprimiert und unter Verwendung von Röntgenkristallstrukturen auf Nirmatrelvir-Hemmung und enzymatische Aktivität untersucht.

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Röntgenkristallstrukturen von Mpro-Mutanten.  Jede Mutantenstruktur ist an der entsprechenden WT-Struktur ausgerichtet, die weiß dargestellt ist (apo, PDB 7JP1; GC-376-Komplex, 6WTT; Nirmatrelvir-Komplex, 7RFW).  Bei den mutierten Strukturen sind GC-376 und Nirmatrelvir in Cyan bzw. Neongrün dargestellt.  WT-HBs sind als schwarze Striche für ausgewählte Reste an den Mutationsstellen oder zwischen dem Protein und dem Inhibitor gezeigt.  Mutierte HBs sind als rote Striche gezeigt.  Mutationen sind mit rotem Text gekennzeichnet.  Der S1-Rest vom N-Terminus des benachbarten Protomers ist orange markiert.  Die Seitenkette von L141 ist nicht gezeigt.  (A) Apo Mpro S144A (Magenta, PDB 8D4L).  (B) Apo Mpro S144L (orange, PDB 8DFE).  Die Ansicht für Tafel B ist leicht verschoben, um die Bewegung des benachbarten N-Terminus zu zeigen.  (C) Apo Mpro H172Y (grün, PDB 8D4J).  (D) Mpro S144A GC-376-Komplex (Magenta, PDB 8D4M).  (E) Mpro S144L GC-376-Komplex (orange, PDB 8DD9).  (F) Mpro H172Y GC-376-Komplex (grün, PDB 8D4K).  Der S1-Rest ist ungeordnet.  (G) Apo Mpro E166Q (blau, PDB 8D4N).  (H) Mpro Q192T GC376-Komplex (lila, PDB 8DGB).  (I) Mpro M165Y Nirmatrelvir-Komplex (braun, PDB 8DCZ).

Röntgenkristallstrukturen von Mpro-Mutanten. Jede Mutantenstruktur ist an der entsprechenden WT-Struktur ausgerichtet, die weiß dargestellt ist (apo, PDB 7JP1; GC-376-Komplex, 6WTT; Nirmatrelvir-Komplex, 7RFW). Bei den mutierten Strukturen sind GC-376 und Nirmatrelvir in Cyan bzw. Neongrün dargestellt. WT-HBs sind als schwarze Striche für ausgewählte Reste an den Mutationsstellen oder zwischen dem Protein und dem Inhibitor gezeigt. Mutierte HBs sind als rote Striche gezeigt. Mutationen sind mit rotem Text gekennzeichnet. Der S1-Rest vom N-Terminus des benachbarten Protomers ist orange markiert. Die Seitenkette von L141 ist nicht gezeigt. (A) Apo Mpro S144A (Magenta, PDB 8D4L). (B) Apo Mpro S144L (orange, PDB 8DFE). Die Ansicht für Tafel B ist leicht verschoben, um die Bewegung des benachbarten N-Terminus zu zeigen. (C) Apo Mpro H172Y (grün, PDB 8D4J). (D) Mpro S144A GC-376-Komplex (Magenta, PDB 8D4M). (E) Mpro S144L GC-376-Komplex (orange, PDB 8DD9). (F) Mpro H172Y GC-376-Komplex (grün, PDB 8D4K). Der S1-Rest ist ungeordnet. (G) Apo Mpro E166Q (blau, PDB 8D4N). (H) Mpro Q192T GC376-Komplex (lila, PDB 8DGB). (I) Mpro M165Y Nirmatrelvir-Komplex (braun, PDB 8DCZ).

Ergebnisse

Die Autoren fanden 66 gemeinsame SARS-CoV-2 MProfi an der Nirmatrelvir-Bindungsstelle positionierte Mutationen, die alle hochfrequenten Mutanten an den 12 analysierten Resten umfassen.

Nach dem kcat/Km-Wert für die enzymatische Aktivität und dem Ki-Wert für die Arzneimittelresistenz ist der MProfi Mutanten wurden in drei Kategorien eingeteilt: Kategorie 1 enthält essentielle Reste für die enzymatische Aktivität (H163 und H41); Kategorie 2 enthält Hot-Spot-Rückstände für Arzneimittelresistenz (M165, S144, H172, E166 und Q192); und Kategorie 3 umfasst Reste, die mehreren Mutationen widerstehen können, ohne die Arzneimittelhemmung und die enzymatische Aktivität wesentlich zu beeinflussen (M49, T135, N142, Q189 und H164).

Die meisten MProfi Mutanten zeigten eine verminderte enzymatische Aktivität, dh kcat/Km, die größer als eine 10-fache Abnahme ist. Andererseits zeigten 11 Mutanten, darunter M165T, S144M/F/A/G/Y, H172Q/F, E166Q und Q192T/S/V, eine ähnliche enzymatische Aktivität wie der SARS-CoV-2-Wildtypstamm mit kcat/km weniger als eine 10-fache Modifikation und Resistenz gegen Nirmatrelvir mit Ki größer als eine 10-fache Erhöhung.

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Obwohl die enzymatische Aktivität mehrerer Einzelmutanten, die in dieser Untersuchung gefunden wurden, verringert war, war es denkbar, dass das Virus mehrere Mutationen hervorbringen könnte, wie z.

Außerdem zeigten die Röntgenstrukturen, wie MProfi Mutationen beeinflussten die Konformationsstabilität des aktiven Zentrums und verringerten die Ligandenbindung. Röntgenstrukturen von sechs Einzelmutanten mit oder ohne Nirmatrelvir/GC-376 wurden erstellt.

Das Team stellte fest, dass die Mutanten eine produktive Konfiguration annehmen, wenn ein Substrat oder Inhibitor vorhanden ist, was erklärt, wie sie die Reaktion katalysieren können. Die Verringerung der katalytischen Eigenschaften der Mutanten und die Hemmung durch Nirmatrelvir/GC-376 scheinen durch zwei Faktoren verursacht zu werden: ein entropischer Effekt aufgrund der erhöhten Konformationsinstabilität des aktiven Zentrums und ein enthalpischer Einfluss, der durch die direkte Unterbrechung der Ligandenbindungskontakte verursacht wird .

Schlussfolgerungen

Insgesamt fanden die Autoren in der aktuellen Forschung 66 arzneimittelresistente MProfi Mutanten aus natürlichem SARS-CoV-2-Polymorphismus aus der GISAID-Datenbank. Diese Mutationen können sich auf die Wirksamkeit von Paxlovid auswirken, und die kontinuierliche Verschreibung von Paxlovid könnte wahrscheinlich die Prävalenz dieser bereits bestehenden Arzneimittelresistenzmutanten erhöhen.

Die Hotspots der Nirmatrelvir-Resistenz, MProfi M165-, S144-, H172-, E166- und Q192-Mutanten müssen aktiv über die zirkulierenden SARS-CoV-2-Infektionen hinweg überwacht werden. Höchstwahrscheinlich führen Mutationen an diesen Resten zu einer beträchtlichen Arzneimittelresistenz, während die Enzymfunktion aufrechterhalten wird. Ob diese Mutationen die virale Replikationsfähigkeit und Übertragung verringern, muss weiter untersucht werden.

Doppel- oder Dreifachmutanten können entstehen, um dem Verlust der enzymatischen Funktion aus der Einzelmutante entgegenzuwirken und gleichzeitig die Arzneimittelresistenz zu verbessern oder aufrechtzuerhalten, wie bei der H172Y/Q189T-Mutante zu sehen ist. Daher ist es wichtig, den M zu verfolgenProfi Mutanten mit verringerter enzymatischer Aktivität aus der aktuellen Studie.

*Wichtiger Hinweis

bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Fachleuten begutachtet sind und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten leiten oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

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